Saatos 25 dinten inkubasi statis dina suhu 28°C, lakase ti *Pleurotus ostreatus* NRC620 nunjukkeun aktivitas pangluhurna dina média kultur jamur. Nilai pH sareng suhu optimal pikeun énzim ieu nyaéta 3,0 sareng 70°C, masing-masing. Saatos 2 jam inkubasi dina suhu 40°C sareng 50°C, aktivitas énzim tetep 68,33% sareng 59,61%, masing-masing. Saatos 2 jam inkubasi dina buffer sitrat-fosfat (pH 7,0), aktivitas énzim tetep dina 100%. Panambahan 10 mM MgSO₄ sareng CuSO₄ ningkatkeun aktivitas énzim masing-masing sakitar 21% sareng 35%, sedengkeun NaCl, MnCl₂, KCl, sareng CaCl₂ ngahambat aktivitas énzim. Ngagunakeun ABTS salaku substrat, parameter kinétik (Km sareng Vmax) tina *Pleurotus ostreatus* NRC 620 laccase nyaéta 1,99 mM sareng 16.217 μmol min−1 L−1, masing-masing. Perlakuan énzimatik sampel jus apel sacara signifikan ngirangan pH sareng viskositas, sareng réduksi ieu berkorelasi sareng paningkatan waktos panyimpenan. Perlakuan laccase nyababkeun panurunan sakedik dina total eusi fenolik jus apel, tapi teu aya panurunan dina aktivitas antioksidan anu dititénan.
Dina sababaraha taun ka pengker, para panaliti parantos museurkeun kana aplikasi biotéhnologi héjo dina industri pangan. Laccase mangrupikeun salah sahiji énzim anu paling kapaké dina industri pangan, mendakan aplikasi dina widang sapertos pamrosésan jus, baking, stabilisasi anggur, sareng ningkatkeun kualitas organoleptik produk pangan.1Seueur tutuwuhan tingkat luhur sareng mikroorganisme anu ngaluarkeun lakase,2jeung jamur saperti deuteromycetes, ascomycetes, jeung basidiomycetes ogé bisa ngahasilkeun laccase.3Lakase (EC 1.10.3.2) nyaéta oksidase biru anu ngurangan oksigén molekuler jadi cai ngagunakeun sistem anu diwangun ku tilu atom tambaga anu béda, sahingga ngaoksidasi rupa-rupa sanyawa fenolik sareng amina aromatik. Salila produksi jus buah sareng sayuran, pencoklatan énzimatik sareng nonenzimatik mangrupikeun masalah anu penting.4Kusabab zat-zat ieu mangaruhan négatif kana warna, rasa, sareng aroma jus, éta kedah dipiceun.5
Ti sakumna buah, apel mangrupikeun anu paling seueur dikonsumsi di sakumna dunya sareng di Uni Éropa. Dina taun 2019, produksi apel rengking katilu sacara global, ngaleuwihan 87 juta ton.6Apel ngandung seueur sanyawa fenolik, kalebet flavonoid sareng asam fenolik sapertos asam kafein sareng asam klorogenik.7Kusabab jus apel biasana dikonsumsi dina bentuk anu bening, sakitar 50% dugi ka 90% komponén fenolik leungit nalika prosés filtrasi.8Ayeuna, konsumen condong milih produk anu diolah minimal, sapertos jus apel keruh anu ngandung polifenol anu luhur. Nanging, kusabab kandungan fenolikna anu luhur, jus apel jinis ieu rentan pisan kana perubahan warna sareng janten poék.9Rupa-rupa téknologi, kalebet metode perlakuan panas sapertos pasteurisasi dina suhu 60–90°C, dianggo pikeun ngirangan atanapi nyegah warna jus apel jadi poék.10Sanajan kitu, nurutkeun panalungtikan ku Sauceda-Gálvez11, pamrosésan termal tiasa ngancurkeun bahan kimia anu gampang nguap sareng mangaruhan kualitas organoleptik jus apel. Alternatif pikeun metode pamrosésan termal kalebet karbon dioksida superkritis, radiasi ultraviolét, ultrasound, tekanan hidrostatik anu luhur, atanapi homogenisasi tekanan tinggi.12Efisiensi téknologi ieu sareng hasil jus buah anu cocog gumantung kana parameter anu dianggo sareng karakteristik produk. Panggunaan anu nyebar diwatesan ku biaya anu luhur, pangaruh négatif kana kualitas sababaraha produk pangan, atanapi inaktivasi énzim anu teu cekap.13,14
Laccase bisa dipaké pikeun ngastabilkeun jeung ngajéntrékeun sari buah.15Gökmen et al.16nyarankeun panggunaan laccase pikeun klarifikasi jus buah sabab sacara efektif miceun sanyawa fenolik ku cara ngarobahna jadi polimér atanapi oligomer anu gampang dipiceun ku mémbran ultrafiltrasi naon waé, ngamungkinkeun jus apel pikeun ngajaga warna sareng kajelasan anu stabil dugi ka genep minggu dina suhu 50°C. Laccase *Trichoderma* anu dimurnikeun diimobilisasi dina manik-manik alumina sareng dianggo pikeun sacara selektif miceun sanyawa anu teu raos anu disababkeun ku kontaminasi mikroba jus apel.17
Kira-kira 80-90% komponén volatil dina jus apel nyaéta éster sareng aldehida, anu masihan aroma anu unik kana jus éta.18Lakcase tina *Trametes versicolor* diimobilisasi dina pangrojong murah anu didamel tina serat alami tina batok kalapa ngora pikeun klarifikasi jus apel.19Panilitian samemehna parantos nalungtik stabilisasi jus apel (warna sareng kekeruhan) nganggo metode bébas énzim atanapi imobilisasi, atanapi digabungkeun sareng ultrafiltrasi.5,19Nanging, pangaruh lakkas jamur kana sipat fisikokimia jus apel salami panyimpenan masih teu jelas. Ku kituna, tujuan panilitian ieu nyaéta pikeun nalungtik sacara ékspériméntal parobahan dina sipat fisikokimia, eusi sanyawa fenolik, sareng aktivitas antioksidan jus apel saatos dirawat ku lakkas jamur sareng panyimpenan dina kulkas dua minggu. Lakkas gaduh kamampuan pikeun ngoksidasi sanyawa fenolik, anu ngajantenkeun aranjeunna ngajangjikeun pikeun dianggo dina rupa-rupa prosés industri, kalebet klarifikasi jus. Panilitian ieu nalungtik lakkas tina *Pleurotus ostreatus* NRC 620, fokus kana kaayaan idéal pikeun aktivitas sareng efektivitasna dina klarifikasi jus. Sanaos panilitian ngeunaan jamur tiram (P. ostreatus NRC 620) masih terbatas, panilitian sateuacana parantos nalungtik énzim tina rupa-rupa sumber jamur, sapertos Trametes versicolor sareng Ganoderma lucidum. Tujuan panilitian ieu nyaéta pikeun meunteun poténsi aplikasi énzim ieu dina industri pangan sareng nyorot sipat unikna, khususna pH sareng suhu idéalna.
2,2′-Azooxybis (3-etilbenzotiazolin-6-asam sulfonat) (ABTS) dipésér ti Sigma-Aldrich (Kanada). Sadaya réagen anu sanésna gaduh kelas analitis.
Pusat Koleksi Kultur Mikroba Pusat Panalungtikan Nasional kéngingkeun galur supa tiram anu dipikanyaho NRC620. Saatos subkultur, galur ieu disimpen dina miring agar dekstrosa kentang dina suhu 4°C. Métode persiapan inokulum nyaéta sapertos kieu: miselium umur 10 dinten anu parantos dimekarkeun sapinuhna diinokulasi kana pelat agar dekstrosa kentang sareng diinkubasi dina suhu 28°C. Saatos 10 dinten, tilu blok miselium diaméter 12 mm dipiceun tina média agar nganggo pelubang logam steril sareng disimpen dina labu Erlenmeyer 250 mL nganggo colokan kapas anu ngandung 50 mL média kultur anu disterilisasi (pH 5.0, sapertos anu dijelaskeun sateuacanna ku Othman et al.20). Kultur diinkubasi dina suhu 28°C salami 18 dinten. Kultur teras disaring nganggo kertas saring Whatman No. 1, sareng supernatan anu dihasilkeun janten sumber énzim.
Aktivitas lakkas ditangtukeun nganggo ABTS salaku substrat. Campuran réaksi (2 mL) ngandung 500 μL 0,3 mM ABTS (dilarutkeun dina 0,1 M buffer natrium sitrat, pH 4,5) sareng jumlah sampel énzim anu diperyogikeun anu diéncérkeun ku cai sulingan.21,22Nganggap yén laccase tiasa ngoksidasi ABTS dina suhu kamar (28 °C ± 2), oksidasi ABTS ditangtukeun ku cara ngukur paningkatan absorbansi dina 420 nm (ε420= 36.000 cm-1 M -1) ngagunakeun spektrofotometer UV Agilent Carry-100. Hiji unit aktivitas laccase diperyogikeun pikeun ngoksidasi 1 μmol ABTS per menit. Konsentrasi protéin ditangtukeun ku metode Bradford ngagunakeun albumin sérum sapi salaku kontrol internal.23,24
Saatos kéngingkeun énzim tina galur supa tiram NRC 620, aktivitasna diukur dina interval budidaya anu béda salami 25 dinten dina kaayaan statis dina suhu 28 °C.
Pikeun nalungtik pangaruh suhu kana aktivitas laccase, ékspérimén dilaksanakeun dina kisaran suhu ti 20 dugi ka 90 °C. Sateuacan nambihan énzim sareng ngamimitian réaksi, buffer (0,1 M natrium sitrat, pH 4,5) sareng substrat (ABTS) dicampur sareng diinkubasi salami 5 menit dina rupa-rupa suhu. Stabilitas termal énzim ditaksir ku cara inkubasi dina buffer natrium fosfat 0,05 M (pH 7,0) dina suhu 40, 50, 60, sareng 70 °C salami 2 jam. Aktivitas sésa teras ditaksir nganggo substrat ABTS.
Pangaruh pH kana aktivitas laccase dipeunteun nganggo ABTS salaku substrat dina buffer sitrat-fosfat 0,1 M kalayan rentang pH 2,5 dugi ka 7,0. Larutan énzim diinkubasi dina suhu 40°C salami dua jam dina buffer sitrat 0,1 M sareng Tris (pH 3, 4, 6, sareng 7) pikeun meunteun stabilitas pH. Aktivitas sésa sareng ABTS salaku substrat diitung saatos inkubasi.
Lakase diinkubasi salami 10 menit dina buffer natrium fosfat (0,05 M, pH 7,0) anu ngandung rupa-rupa ion logam (Mg2+, Cu2+, Co2+, Ca2+, Zn2+, K+, Na+, sareng Mn2+) dina konsentrasi 2,5 mM sareng 10 mM, masing-masing. Substrat (ABTS) teras ditambahkeun pikeun ngamimitian réaksi, sareng aktivitas relatifna ditaksir.
Oksidasi ABTS ku laccase dina rupa-rupa konsentrasi (0,025–3 mM) diukur dina pH 4,5 pikeun nangtukeun parameter kinétik (Vmax sareng Km). Kinétiknakonstantatina persamaan Michaelis-Menten diitung nganggo plot Lineweaver-Burk, anu ngaplot timbal balik tina laju réaksi salaku fungsi konsentrasi substrat. Konstanta kinétik diitung tina plot Lineweaver-Burk nganggo parangkat lunak GraphPad Prism versi 6.01.
Saatos apel dikumbah tuntas ku cai ledeng, éta apel dipotong satengah teras diperes nganggo juicer apel Braun MP80 otomatis (diproduksi di Jerman). Jusna disaring nganggo opat lapis lawon katun. Teu aya énzim anu ditambahkeun kana grup kontrol, sedengkeun 2,0% laccase (konsentrasi anu paling efektif anu diuji) ditambahkeun kana jus apel anu nembé disiapkeun, anu teras disimpen dina suhu 4°C salami dua minggu.
Kaasaman anu tiasa dititrat (TA) sareng pH ditangtukeun numutkeun metode Boulton et al.al.27. pH unggal sampel diukur nganggo pH meter digital (JENWAY 3510 pH meter). Kaasaman anu tiasa dititrasi (TA) diitung dumasar kana asam malat nganggo rumus ieu di handap.
dimana V sareng C nyaéta volume (mL) sareng konsentrasi (0,1 mol/L) tina larutan natrium hidroksida anu dianggo dina titrasi, masing-masing. K nyaéta koéfisién konvérsi asam malat, sami sareng 0,067, sareng W nyaéta massa (g) jus apel.
Total padatan leyur (TDS) eusi sadaya sampel jus ditangtukeun nganggo refraktometer saku PAL-1 (ATAGO, Tokyo, Jepang). Saatos unggal pangukuran, lénsa optik dibilas ku cai deionisasi, sareng unggal sampel jus apel diuji tilu kali. Nilai pikeun unggal sampel diitung ku cara ngarata-ratakeun tilu pangukuran. Rata-rata ± simpangan baku pikeun unggal sampel jus apel ogé diitung ku cara ngarata-ratakeun hasil ieu.
Viskoelastisitas sampel jus apel ditaksir nganggo viskometer rotasi (RV, Rheotest 2, Jerman). Sampel disimpen di jero silinder "S2" viskometer. Viskositas semu digambarkeun ku lamping kurva tegangan geser ngalawan laju geser, anu diitung tina tegangan geser sareng kurva anu saluyu dina rupa-rupa laju geser (ti 1,00 dugi ka 437,4 s⁻¹). Rumus pikeun ngitung viskositas semu nyaéta sapertos kieu:
Dimana η nyaéta viskositas anu katingali (cP), τ nyaéta tegangan geser (dyn/cm²), γ nyaéta laju geser (sec⁻¹), sareng (τ) diitung nganggo nilai torsi (α) sareng silinder (Z) nganggo rumus ieu: τ = Z. α.
Indéks pencoklatan ditangtukeun dumasar kana metode Meidav etal.29Sampel jus 10 ml disentrifugasi dina 2750 xg salami 10 menit. 5 ml supernatan jus dicampur sareng 5 ml étanol 95%. Absorbansi campuran diukur dina 420 nm nganggo spektrofotometer UV Shimadzu (UV-1601 PC).
Kandungan fenolik total (TPC) ditangtukeun sacara kolorimetri nganggo réagen Folin-Ciocalteu sakumaha anu dijelaskeun ku Boulton et al.[27]Kurva standar asam galat diwangun pikeun konsentrasi ti 0 dugi ka 500 mg/L (r²= 0.997). Hasilna dinyatakeun salaku sarimbag asam galat (mg GAE/mL).
Tambahkeun 125 μL cai sulingan sareng 2850 μL larutan FRAP kana 25 μL jus apel teras tinggalkeun campuran dina tempat anu poék salami30mnt. Teras ukur absorbansi dina 593 nm nganggo spektrofotometer UV Shimadzu (UV-1601 PC). Réagen FRAP disiapkeun ku cara nyampur 300 mM buffer asetat (pH 3.6), 20 mM beusi (III) klorida, sareng 10 mM 2,4,6-tris (2-piridil) triazina (TPTZ) (dilarutkeun dina 40 mM HCl) dina babandingan 10:1:1. Kurva standar dihasilkeun nganggo Trolox salaku standar (R²= 0.999), sareng hasilna dinyatakeun salaku μM Trolox/mL.
Aktivitas antioksidan tina jus anu diolah sareng anu henteu diolah ditangtukeun nganggo metode DPPH pikeun meunteun kamampuanna dina ngabersihkeun radikal bébas DPPH.31Sapuluh mikroliter jus dicampur sareng 1 ml larutan DPPH (100 μM) dina metanol. Saatos réaksi dina poék salami 30 menit, absorbansi campuran diukur dina 517 nm nganggo spektrofotometer UV Shimadzu (UV-1601 PC). Hasilna dinyatakeun salaku sarimbag trolox (μM trolox/ml) dumasar kana kurva kalibrasi (R2= 0.990).
Data anu diala nunjukkeun yén produksi lakase maksimum katingali dina jamur tiram NRC 620 dina ahir dinten ka-18 fermentasi, ngahontal aktivitas 1302 U/L. Ieu janten dasar pikeun nangtukeun waktos budidaya optimal pikeun produksi lakase (Gambar 1). Sanaos produksi énzim ningkat kalayan ningkatna waktos budidaya, laju paningkatan henteu langsung sabanding sareng waktos budidaya; saatos 21 dinten, aktivitas énzim ngan ukur ningkat 90 U/L (dugi ka 1390 U/L). Ku alatan éta, 18 dinten pamustunganana dipilih salaku waktos budidaya optimal pikeun ngimbangan hasil produk sareng kauntungan ékonomi tina ningkatna waktos budidaya.
Pangaruh waktos budidaya kana hasil laccase dina Pleurotus ostreatus NRC 620. Tilu blok miselium jamur (12 mm) diinokulasi kana 50 ml média steril teras dibudidayakeun dina suhu 28 °C pikeun waktos anu béda.
Saluyu sareng panilitian anu sanés, hasil panilitian kami nunjukkeun yén période kultur anu idéal pikeun ngahontal sékrési laccase puncak ku jamur kamungkinan antara 7 sareng 36 dinten.32Numutkeun Ezike et al.33, *Trametes polyzona* WRF03 ngahasilkeun jumlah lakase pangluhurna dina ahir dinten kasalapan fermentasi, kalayan aktivitas spésifik protéin 1637 U/mg. Salajengna, Othman et al.34mendakan yén *Trichoderma harzianum* S7113 ngaluarkeun seueur laktase dina dinten kalima budidaya. Laju produksi laktase ngahontal puncak aktivitas dina dinten kaopat belas teras laun-laun turun.34Sanaos sékrési énzim ogé tiasa lumangsung salami fase kamekaran utama, biasana puncakna salami fase panengah sareng dipicu ku konsumsi sumber karbon atanapi nitrogén.34,35
Sanaos laccase ti Pleurotus ostreatus NRC 620 nunjukkeun aktivitas anu luhur dina rentang suhu anu lega ti 50°C dugi ka 80°C, ampir ngahontal puncak aktivitas (69–98%), aktivitas maksimumna katingali dina 70°C (Gambar 2a). Di luar rentang suhu ieu, aktivitas énzim turun sakitar 70°C. Hasil ieu nunjukkeun yén énzim aktip dina suhu anu luhur, kamungkinan kusabab suhu anu luhur ningkatkeun énergi kinétik réaksi.
Pangaruh suhu réaksi (a) sareng pH (b) kana aktivitas laccase dina *Pleurotus ostreatus* NRC 620. Suhu anu mimitian ti 20 dugi ka 90 °C kahontal ku cara ngainkubasi campuran dina suhu anu béda salami 5 menit sateuacan nambihan énzim sareng ngamimitian réaksi. Pangaruh pH kana aktivitas laccase ditaksir nganggo ABTS salaku substrat dina larutan anu ngandung 0,1 M buffer sitrat-fosfat dina kisaran pH 2,5 dugi ka 7,0.
Numutkeun Ezike et al.al.33, suhu optimal pikeun *Trametes polyzona* WRF03 laccase nyaéta 55 °C, anu sami sareng pikeun *Ganoderma lucidum*laccase36sareng sami sareng suhu optimal (50 °C) kanggo *Trametes polyzona* KU-RNW02737laccase . Baldrian38nyatet yén, sapertos pikeun sistem énzim anu ngadegradasi lignin anu sanés, kisaran suhu anu idéal pikeun laccase nyaéta antara 50 sareng 70 °C.
Hasilna nunjukkeun yén énzim ieu némbongkeun aktivitas pangluhurna dina pH 3.0, ngahontal aktivitas 94% dina pH 3.5. Nanging, éta tetep aktip dina rentang pH anu lega ti 2.5 dugi ka 7.0 (Gambar 2b). Salajengna, éta némbongkeun aktivitas anu langkung luhur dina kaayaan asam dibandingkeun sareng kaayaan nétral atanapi basa. Aktivitasna tetep sahenteuna 77% dina rentang pH ti 2.5 dugi ka 4.5, tapi ngan ukur ngahontal sakitar 38% dina pH 7.0. pH optimum pikeun laccase ti *Trametes polyzona* WRF03 nyaéta 4.533, anu sami sareng pH pikeun laccase ti *Trametes polyzona* KU-RNW02737, *Trichoderma harzanium* 39, *Pleurotus* sp. 40, sareng *Trametes hirsuta* 41. Nanging, numutkeun panilitian ku Chairin et al.42, pH optimal pikeun laccase ti *Polymorpha f. sp.* WR710-1 nyaéta 2,2, sedengkeun pH optimal pikeun laccase ti *Polymorpha f. sp.* IBL-04 nyaéta 5,043. Beungkeutan anion hidroksida (inhibitor laccase) kana atom tambaga laccase T2/T3 tiasa janten alesan turunna aktivitas laccase dina kaayaan pH nétral atanapi basa. Ieu tiasa ngaganggu transfer éléktron internal ti puseur T1 ka puseur T2/T3, ku kitunangawatesanaktivitas énzim23,44
Ku cara ngainkubasi énzim dina suhu anu béda-béda, kapanggih yén waktos inkubasi sareng suhu mangaruhan stabilitas énzim. Anu penting, laccase ti *Trametes polyzona* NRC 620 nunjukkeun stabilitas anu langkung luhur dina 40℃ sareng 50℃, masing-masing nahan 68,33% sareng 59,61% tina aktivitas awalna, saatos 120 menit (Gambar 3a). Sabalikna, dina kaayaan anu sami (40℃ sareng 50℃, 120 menit), laccase ti *Trametes polyzona* WRF03 masing-masing nahan 64,38% sareng 42,92% tina aktivitasna.33Sabalikna, ningkatna waktos sareng suhu inkubasi ngirangan stabilitas *Trametes polyzona* NRC 620 laccase; Saatos inkubasi dina suhu 60℃ sareng 70℃ salami 60 menit, aktivitasna turun janten 39,24% sareng 1,72%, masing-masing (Gambar 3a). Saluyu sareng hasil ékspérimén, laccase tina *Trametes polyzona* WRF03 nunjukkeun stabilitas anu langkung luhur dina suhu 40 sareng 50℃ sapanjang prosés perlakuan termal.33Sarua kitu, Lueangjaroenkit etal.37sareng Chairin etal.42ngalaporkeun stabilitas laccase tina Trametes polyzona KURNW027 sareng Trametes polyzona WR710-1 dina suhu 50 °C salami 1 jam, masing-masing. Salaku biokatalis anu kapaké anu tiasa diterapkeun dina rupa-rupa widang biotéhnologi, laccase kedah gaduh stabilitas sareng kinerja anu saé dina rentang suhu anu lega.
Stabilitas termostatik (a) sareng stabilitas pH (b) laccase tina *Pleurotus ostreatus* NRC 620. Stabilitas termostatik ditaksir ku cara ngainkubasi larutan énzim dina 0,05 M buffer natrium fosfat (pH 7,0) dina suhu 40, 50, 60, sareng 70 °C salami 2 jam. Stabilitas pH ditaksir ku cara ngainkubasi larutan énzim dina 0,1 M buffer sitrat sareng buffer Tris (pH 3, 4, 6, sareng 7) dina suhu 40 °C salami 2 jam. Aktivitas sésa diitung nganggo ABTS salaku substrat saatos inkubasi.
Pikeun nangtukeun kaayaan optimal pikeun panggunaan sareng panyimpenan énzim, kami nalungtik pangaruh pH kana stabilitas laccase. Paparan kana nilai pH anu béda-béda mangaruhan sacara signifikan stabilitas struktur protéin, sahingga mangaruhan stabilitas sareng aktivitas molekul énzim. Hasilna nunjukkeun yén énzim kirang stabil dina kaayaan asam, sedengkeun éta nunjukkeun stabilitas anu langkung saé dina nilai pH anu langkung luhur (daérah nétral sareng basa). Dina nilai pH 7,0, 6,0, 4,0, sareng 3,0, laju ingetan énzim saatos 120 menit masing-masing sakitar 100%, 62,54%, 52,39%, sareng 11,14% (Gambar 3b). *Strombus multisus* WRF03 laccase nunjukkeun stabilitas anu langkung luhur dina nilai pH nétral (5,5–6,5) sareng stabilitas anu langkung handap dina nilai pH asam (di handap 4,0). Saatos 120 menit dina nilai pH 5,5, 6,0, sareng 6,5, laju ingetan énzim masing-masing sakitar 82%, 100%, sareng 93%.33Khairin et al.42nyatet yén laccase ti Trametes polyzona WR710-1 stabil dina kisaran pH 6,0 dugi ka 7,0, sedengkeun Sayed et al.45némbongkeun yén laccase leuwih stabil dina kaayaan pH nétral. Nanging, laccase ti Cerrena unicolor ogé némbongkeun stabilitas dina kaayaan basa (pH 9.0)46. Lakase anu ditalungtik nunjukkeun stabilitas anu luhur dina rentang pH anu lega. Ieu tiasa janten ciri anu penting pikeun aplikasi industri.
Kusabab sababaraha ion logam gaduh pangaruh stimulasi sareng inhibisi kana aktivitas énzim, pangaruhna kana aktivitas énzim kedah dipertimbangkeun dina aplikasi industri. Ieu penting pisan sabab ion logam mangrupikeun kontaminan lingkungan umum anu tiasa mangaruhan stabilitas sareng sintésis énzim ékstrasélulér.47Pikeun nalungtik pangaruh sababaraha ion logam kana laccase tina *Pleurotus ostreatus* NRC 620, kami ngalaksanakeun ékspérimén anu saluyu. Sakumaha anu dipidangkeun dina Gambar 4, gumantung kana jinis logam anu dianggo, ningkatkeun konsentrasi ion logam tina 2,5 mM janten 10 mM mangaruhan négatif fungsi énzim. Salaku conto,Mg²⁺ , Co²⁺ , Zn²⁺, jeungCu²⁺bisa ngarangsang jeung ngaktipkeun aktivitas énzim, sedengkeunNa⁺ , Mn²⁺ , Ca²⁺, jeungK⁺bisa ngahalangan aktivitas énzim. Dina konsentrasi 10 mM, ion Cu²⁺ jeung Mg²⁺ mangrupa aktivator aktivitas lakase anu pangkuatna ti *Pleurotus ostreatus* NRC 620, anu masing-masing nyadiakeun tingkat aktivasi sakitar 34% jeung 20%. Sanajan kitu, dina konsentrasi 10 mM, ion Ca²⁺ mangrupa inhibitor lakase anu pangkuatna, anu ngurangan aktivitas énzim sakitar 60%.
Pangaruh ion logam kana aktivitas Pleurotus ostreatus NRC 620 laccase. Laccase diinkubasi salami 10 menit dina buffer natrium fosfat (0,05 M, pH 7,0) anu ngandung rupa-rupa ion logam dina konsentrasi 2,5 mM sareng 10 mM. Réaksi teras dimimitian ku panambahan substrat (ABTS), saatos éta aktivitas relatif diukur.
Hasil panilitian kami saluyu sareng hasil panilitian pangarang sanés anu mendakan yén Mg²⁺ sareng Cu²⁺ ningkatkeun aktivitas *Trametes polyzona* WRF03³. Castaño et al.⁴⁸ mendakan yén laccase ti *Xylaria* sp. dirangsang dugi ka tingkat anu tangtu ku ion tambaga (Cu²⁺). Salajengna, Foroutanfar et al.⁴⁹ sareng Si et al.⁵⁰ ngalaksanakeun panilitian anu sami ngeunaan laccase ti *Paraconiothyrium variabile* sareng *Trametes pubescens*, masing-masing. Situs pangiket tambaga tipe II (T2) tina énzim ieu tiasa jenuh ku Cu²⁺ dina konsentrasi anu ditangtukeun, anu tiasa ngajelaskeun stimulasi aktivitas laccase dina konsentrasi Cu²⁺³⁹ anu langkung luhur. Kusabab lakase jamur buruk bodas mangrupikeun oksidase anu ngandung sababaraha atom tambaga, pangaruh ion tambaga kana aktivitas lakase rupa-rupa sareng mimitian ti stimulasi sareng inhibisi dugi ka nétral.⁵¹ Sabalikna, Zhou et al.[52]ngalaporkeun yénCu²⁺ngahambat aktivitas laccase rayap handapeun taneuh Taiwan (Odontotermes formosanus). Nanging, laccase Cerena sp. HYB07[53]jeung Clitocybe maxima[54]teu kapangaruhan ku ion tambaga.
Spésifisitas substrat digambarkeun ku parameter kinétikna (Km sareng Vmax); beuki kuat afinitas pangiket substrat kana énzim, beuki handap nilai Km sareng beuki luhur spésifisitas substrat.3,21,55Parameter kinétik (Km sareng Vmax) tina laccase tina *Pleurotus ostreatus* NRC 620 ditangtukeun nganggo parangkat lunak GraphPad Prism 6.0 ku cara ngaplot plot Lineweaver-Burk (Gambar 5). Nalika nganggo ABTS salaku substrat, hasilna nyaéta 1,99 mM sareng 16217 μmol.menit⁻¹ L⁻¹,masing-masing. Elsayed et al.21ngalaporkeun yén nilai Km pikeun oksidasi ABTS nyaéta 0,1 mM sareng 0,064 mM, masing-masing, nunjukkeun afinitas isoénzim Lac A sareng Lac B anu luhur pikeun ABTS. Salajengna, nilai Vmax nyaéta 0,182 μmolmenit⁻¹jeung 0,603 μmolmenit⁻¹, masing-masing. Nilai Km anu diala langkung handap tibatan Trametes polyzona WRF03 (8,66 mM); salajengna, nilai Vmax-na (1429 mmol min⁻¹) ogéhandapnalika nganggo ABTS salaku substrat.33 Sarua kitu, nilai Km tina konsentrasi laccase Lentinus squarrosulus MR13 sareng Trametes sp. AH28-2 nyaéta 0,0714 mM sareng 0,025 mM, masing-masing, sareng nilai Vmax nyaéta 0,0091 mM min−1 sareng 0,67 mM min−1 mg−1 (relatif ka ABTS), masing-masing.56,57
Pangaruh konsentrasi ABTS kana aktivitas laccase tina *Pleurotus ostreatus* NRC 620 ditalungtik, sareng plot Lineweaver-Burk tina timbal balik tina kecepatan réaksi awal dibandingkeun konsentrasi ABTS diplot. Réaksi oksidasi ABTS kalayan konsentrasi anu béda (0,025–3,0 mM) laccase diukur dina pH 4,5 pikeun nangtukeun parameter kinétik (Vmax sareng Km). Konstanta kinétik Michaelis-Menten diitung nganggo plot Lineweaver-Burk tina timbal balik tina kecepatan réaksi dibandingkeun konsentrasi substrat. Konstanta kinétik diitung tina plot Lineweaver-Burk nganggo parangkat lunak GraphPad Prism 6.01.
Énzim klarifikasi tradisional, sapertos pektinase, ngahidrolisis zat pektik, ngirangan viskositas sareng turbiditas. Éta sacara efektif ngarecah polisakarida struktural sareng sering dianggo digabungkeun sareng énzim sanés, sapertos selulase sareng hemiselulase, pikeun ningkatkeun hasil sareng kajelasan. Nanging, pektinase henteu khusus narékahan sanyawa fenolik, anu mangrupikeun kontributor utama turbiditas sareng pencoklatan oksidatif, khususna dina jus sapertos jus apel sareng anggur.58Sabalikna, laccase ngatalisis oksidasi sanyawa fenolik, ngapolimerisasina jadi molekul anu langkung ageung sareng teu leyur anu tiasa dipiceun ku sedimentasi atanapi filtrasi. Mékanisme ieu henteu ngan ukur ningkatkeun kajelasan tapi ogé manjangkeun umur simpan jus ku cara ngirangan kamungkinan pencoklatan oksidatif anu disababkeun ku sanyawa fenolik. Salajengna, prosés klarifikasi dumasar laccase tiasa dilaksanakeun dina kaayaan pamrosésan anu hampang (pH 3,5–5,5, suhu 25–40 °C), jantenkeun cocog pikeun jus anu hipu tanpa ngorbankeun sipat nutrisi atanapi organoleptikna.59Panilitian nunjukkeun yén perlakuan pektinase tiasa ngajernihkeun jus dina 1-2 jam, sedengkeun perlakuan lakase biasana meryogikeun waktos réaksi anu langkung lami (3-6 jam) pikeun ngirangan sanyawa fenolik sacara lengkep. Nanging, prosés ieu tiasa dioptimalkeun ku cara ngimobilisasi énzim atanapi ku cara ngagabungkeun lakase sareng metode klarifikasi mékanis.60Dina ieu panilitian, profil énzim tina ekstrak kasar ngungkabkeun aktivitas lakase sareng α-amilase anu signifikan, sedengkeun aktivitas pektinase sareng xilanase rendah pisan, sareng aktivitas selulase henteu kadeteksi. Ku alatan éta, panurunan turbiditas sareng eusi fenolik utamina disababkeun ku aksi lakase, sedengkeun parobahan viskositas tiasa sabagian disababkeun ku aksi amilase.
Tabel 1 nunjukkeun parameter fisikokimia tina jus apel anu nembé diperes sareng sampel anu dirawat laccase. Hasilna nunjukkeun yén hasil jus apel anu nembé diperes (71,59%) langkung handap tibatan sampel anu dirawat laccase (87,34%). Hasil ieu saluyu sareng panemuan Pilnik sareng Orange.61, anu nunjukkeun yén panggunaan énzim dina pamrosésan buah tiasa ningkatkeun hasil jus, ningkatkeun filtrasi, sareng kéngingkeun jus anu kualitasna luhur sareng bening pikeun konsentrasi. Kanaékan hasil jus utamina disababkeun ku paningkatan eusi gula leyur dina jus. Salila hidrolisis énzimatik buah, mesoglea sareng pektin dina témbok sél produk ancur sareng dirobih janten zat leyur sapertos gula nétral sareng asam.62.Nilai pH jus apel anu diolah ku énzim sacara signifikan langkung handap tibatan kelompok kontrol (P < 0,05), sareng nilai pH duanana kelompok ningkat sacara signifikan salami panyimpenan (Tabel 1). Hasil ieu saluyu sareng hasil Mark et al.63, anu nyatet yén pH jus buah jambu mete nurun saatos disimpen saatos perlakuan panas. Degradasi pektin sareng pembentukan asam galakturonat saatos perlakuan énzim tiasa janten panyabab kanaékan pH salami panyimpenan. pH sampel anu dirawat énzim tetep antara 4,05 sareng 4,31 sapanjang panyimpenan, sedengkeun pH jus apel anu henteu dirawat aya antara 4,12 sareng 4,33.
Total kaasaman (TA) tina sampel anu teu diubaran sareng anu teu diubaran laktase nunjukkeun tren anu nurun kalayan ningkatna waktos panyimpenan (Tabel 1). Panurunan kaasaman disababkeun ku konvérsi asam organik janten karbohidrat atanapi réaksi énzimatik, ogé oksidasi salami panyimpenan jus.64Total kaasaman jus apel kontrol sareng sampel anu dirawat énzim langkung handap tibatan jus anu sanés (jus stroberi 0,9%, jus prem 2,2%, jus kumquat 1,0%, jus aprikot 2,4%, jus jeruk 0,8%), tapi sami sareng jus anu sanés (contona, jus pir 0,3%).62Béda-bédana dina jus apel anu nembé diperes anu teu diolah ieu tiasa disababkeun ku sababaraha faktor sapertos kaayaan budidaya, faktor genetik, tingkat kematangan, sareng metode pangolahan.65Panurunan total kaasaman jus apel kontrol sareng anu dirawat laccase saluyu sareng hasil anu dipidangkeun ku Singh et al.66ngeunaan panurunan total kaasaman jus apel Jin Nuo saatos 74 dinten disimpen. Di sisi séjén, Oshmiansky sareng Wojdylo67teu mendakan parobahan anu signifikan dina kaasaman jus apel nalika nalungtik pangaruh metode klarifikasi tradisional.
Hasil anu dipidangkeun dina Tabel 1 nunjukkeun yén nilai total padatan leyur (TSS) tina jus apel anu dirawat ku laccase langkung luhur tibatan sampel anu henteu dirawat. Hasil ieu saluyu sareng panilitian anu diterbitkeun..68Salajengna, Tabel 1 nunjukkeun yén nilai TSS tina grup jus apel kontrol nyaéta 9,58 dina titik waktos awal sareng ngahontal 11,05 dina ahir periode panyimpenan. Nilai-nilai ieu langkung handap tibatan nilai TSS tina jus apel seger anu dilaporkeun ku Hamid et al..69(masing-masing 11,2 sareng 11,80). Nilai TSS tina sampel jus apel anu dirawat laccase ningkat sacara signifikan, dimimitian ti 11,23 sareng ngahontal 12,93 saatos dua minggu disimpen dina suhu 4°C (Tabel 1). Kanaékan TSS anu sami salami panyimpenan ogé katingali dina buah jeruk, lemon, sareng jeruk amis. Kanaékan total padatan leyur (TSS) salami panyimpenan tiasa disababkeun ku hidrolisis polisakarida (pati) janten monosakarida (gula), paningkatan konsentrasi kusabab dehidrasi jus, sareng degradasi pektin dina jus janten padatan leyur. Kanaékan total padatan leyur (TSS) kamungkinan disababkeun ku paningkatan gula leyur, anu tiasa dibentuk ku konvérsi pektin atanapi selulosa janten gula leyur ku pektin atanapi selulase, masing-masing, atanapi ku hidrolisis aci janten gula, sapertos anu dilaporkeun ku Hamed et al.69.Pangaruh laccase kana sipat jus apel tiasa dititénan sacara visual, sabab jus apel anu dirawat laccase nunjukkeun aliran anu langkung saé sareng viskositas anu langkung handap tibatan jus anu henteu dirawat. Observasi ieu kacatet dina Tabel 1; Viskositas sampel anu dirawat énzim nyaéta 1,87 cP, sedengkeun viskositas sampel kontrol nyaéta 2,95 cP. Panurunan viskositas anu signifikan ieu kamungkinan kusabab kapasitas nahan cai anu langkung luhur tina zat sapertos pektin sareng pembentukan struktur jaringan anu kohesif.
Dina ieu panilitian, pangaruh laccase kana indéks browning (BI) jus apel ditalungtik ku cara ngukur absorbansi dina 420 nm nganggo spektrofotometer. Hasilna dipidangkeun dina Tabel 1. Salila panyimpenan, BI sampel jus apel dina kelompok anu dirawat sareng anu henteu dirawat nunjukkeun tren anu ningkat sacara bertahap. BI ngagambarkeun tingkat browning sareng tiasa jantenanu pentingindikator réaksi pencoklatan énzimatik sareng non-énzimatik. Absorbansi ningkat sacara signifikan salami panyimpenan (P < 0,05). Dina ahir panyimpenan,A420Nilai sampel jus apel dina kelompok kontrol sareng kelompok anu dirawat énzim ningkat masing-masing sakitar 217% sareng 121% (Tabel 1). Hasilna nunjukkeun yén perlakuan énzim tiasa sacara efektif ngirangan tingkat pencoklatan sakitar 56%. Hasil Bezerra et al.[19]] saluyu sareng hasil panilitian kami; Aranjeunna nganggo serat lakase-glutaraldehida-kalapa pikeun ngajernihkeun jus apel, ngirangan warna aslina ku 61%.
Sanaos polifenol dina jus buah gaduh pangaruh nutrisi sareng terapi anu positif dina awak manusa, éta ogé tiasa réaksi sareng protéin, nyababkeun jus janten keruh, sedimentasi, atanapi kekeruhan, sahingga ngarobih rasa sareng aroma produk sareng ngirangan umur simpanna.71Tujuan tina ieu panilitian nyaéta pikeun ngirangan eusi sanyawa fenolik dina jus apel sacara aman nganggo laccase tina Pleurotus ostreatus NRC 620. Hasil anu dipidangkeun dina Tabel 1 nunjukkeun yén total eusi sanyawa fenolik tina jus apel anu dirawat laccase turun sacara signifikan sateuacan disimpen dina suhu 4 °C. Salajengna, total eusi sanyawa fenolik ogé turun salami disimpen dina dua sampel anu ditalungtik (Tabel 1). Panilitian ku Sandri et al.72nunjukkeun yén jus apel anu dirawat ku énzim tiasa nahan aktivitas antioksidan sareng eusi sanyawa fenolikna. Nanging, hasil panilitian ku Lettera et al.73nunjukkeun yén perlakuan jus jeruk nganggo laktase jamur tiasa ngirangan eusi sanyawa fenolik di jerona dugi ka 45%.
Sanyawa fenolik geus kabuktian miboga sipat saperti miceun radikal bébas, ngurangan jeung ngaleutikan oksigén singlet, mindahkeun atom hidrogén, jeung nyumbang éléktron ka radikal bébas, nu ngajadikeun éta antioksidan nu kuat.74Ku kituna, dina ieu panilitian, metode dumasar DPPH sareng FRAP dianggo pikeun meunteun pangaruh laccase kana aktivitas antioksidan jus apel anu disimpen dina kulkas salami 14 dinten (Tabel 2). Kadua metode nunjukkeun paningkatan aktivitas antioksidan salami panyimpenan, anu tiasa disababkeun ku paningkatan sanyawa fenolik bébas atanapi pembentukan produk réaksi Maillard (MRP), kalayan produk réaksi Maillard kamungkinan janten panyabab kanaékan aktivitas antioksidan.75Réaksi pencoklatan non-énzimatik (kaasup degradasi asam askorbat, réaksi Maillard, sareng degradasi gula anu dikatalisis ku asam) ngahasilkeun pigmén coklat (melanoidin). Produk degradasi asam askorbat antara sareng produk degradasi gula (sapertos sanyawa karbonil) tiasa ngaréaksikeun sareng asam amino ngalangkungan réaksi Maillard.76Sanaos pencoklatan buah sareng sayuran nalika disimpen parantos ditalungtik sacara éksténsif, pamahaman urang ngeunaan réaksi ieu tetep terbatas.77Dibandingkeun sareng metode FRAP, jus apel anu dirawat laccase nunjukkeun aktivitas antioksidan anu langkung handap sacara signifikan ku metode DPPH (Tabel 2), sareng aktivitas antioksidan sadaya sampel ningkat sacara signifikan kalayan ningkatna waktos panyimpenan. Dua metode anu béda pikeun nangtukeun aktivitas antioksidan dianggo dina panilitian ieu sabab prinsipna béda. Metode DPPH ngukur kamampuan pikeun nétralkeun radikal bébas, sedengkeun metode FRAP ngukur kamampuan pikeun ngirangan ion beusi. Ku alatan éta, disarankeun pikeun nganggo sababaraha metode pikeun nangtukeun aktivitas antioksidan pikeun langkung ngartos aktivitas antioksidan tina sampel anu ditalungtik.78
Salah sahiji panemuan konci tina ieu panilitian nyaéta *Pleurotus ostreatus* laccase NRC 620 nunjukkeun aktivitas optimal dina suhu 70°C sareng pH 3.0. Dibandingkeun sareng laccase jamur sanés anu umumna dianggo pikeun klarifikasi jus, sapertos *Trametes versicolor* sareng *Ganoderma lucidum* laccases, *P. ostreatus* NRC 620 nunjukkeun stabilitas termal anu langkung luhur sareng pH anu langkung asam. Lakcase tina *Trametes versicolor* sareng *Ganoderma lucidum* biasana nunjukkeun aktivitas optimal dina kisaran 50-60°C sareng dina nilai pH antara 3.5 sareng 5.0. Béda ieu tiasa nyumbang kana efisiensi klarifikasi jus anu ningkat, khususna pikeun jus asam dimana stabilitas dina nilai pH anu langkung handap penting pisan. Ciri unik *P. Dibandingkeun sareng laccase jamur sanés anu ditalungtik, *Pleurotus ostreatus* NRC 620 nunjukkeun kamampuan pikeun fungsina sacara efektif dina kaayaan anu langkung nangtang. Suhu aktivitas optimalna anu langkung luhur nunjukkeun kaunggulan poténsial dina aplikasi industri, sapertos laju réaksi anu langkung gancang sareng kontaminasi mikroba anu dikirangan. pH na anu handap, anu cocog pisan sareng sifat asam tina seueur jus, tiasa mangpaat dina prosés klarifikasi jus. Hasil ieu menerkeun éksplorasi salajengna pikeun aplikasi skala ageung, ngajantenkeun *Pleurotus ostreatus* NRC 620 alternatif anu layak pikeun sumber laktase jamur tradisional. Dibandingkeun sareng panilitian sateuacana, kami mendakan yén suhu optimal nyaéta 60°C sareng pH optimal nyaéta 3.0. Saatos réaksi dina 60°C salami 80 menit, laktase *Ganoderma lucidum* tetep aya.46% tina aktivitasna.79 Numutkeun Kurniawati sareng Nicelle80, Énzim *Ganoderma lucidum* némbongkeun stabilitas anu saé pisan dugi ka sedeng dina suhu 25°C sareng nilai pH ti 5,0 dugi ka 8,0, sareng stabilitas dina pH 6,0 sareng suhu ti 10 dugi ka 30°C. Dina panilitian ieu, urang mendakan yén pH sareng suhu optimal pikeun aktivitas énzim pikeun *Pleurotus ostreatus* nyaéta 3,0 sareng 70°C, masing-masing. Saatos inkubasi dina suhu 40°C sareng 50°C salami dua jam, énzim nahan 68,33% sareng 59,61% tina aktivitasna, masing-masing. Salajengna, Pleurotus ostreatus NRC 620 laccase némbongkeun aktivitas anu luhur dina rentang suhu anu lega ti 50°C dugi ka 80°C, ampir ngahontal aktivitas maksimum (69%–98%), kalayan aktivitas maksimum anu dititénan dina 70°C.
Kasimpulanana, jamur tiram laktase NRC620, anu diala dina kaayaan statis, nunjukkeun aktivitas sareng stabilitas anu optimal dina rupa-rupa kaayaan pH sareng suhu, nunjukkeun stabilitas anu langkung unggul dibandingkeun sareng sumber énzim anu sanés. Panambahan 10 mM MgSO₄ sareng CuSO₄ ningkatkeun aktivitas énzim masing-masing sakitar 21% sareng 35%. Nalika diolah janten jus apel, énzim ngirangan pH sareng viskositas, sedengkeun eusi fenolik ngan ukur turun sakedik salami disimpen.
Hasilna mastikeun poténsi laktase dina industri pangan, khususna dina klarifikasi inuman. Ku cara ngarecah sanyawa fenolik sacara khusus, laktase henteu ngan ukur ngirangan turbiditas sareng ningkatkeun kajelasan tapi ogé ngajaga kualitas jus buah dina kaayaan operasi anu hampang. Teu sapertos agén klarifikasi tradisional sapertos gelatin, bentonit, sareng gel silika, laktase henteu ngahasilkeun runtah atanapi miceun aroma anu pikaresepeun tina inuman, jantenkeun éta pilihan anu langkung ramah lingkungan sareng lestari. Salajengna, dibandingkeun sareng énzim sareng metode filtrasi anu sanés, laktase nawiskeun solusi anu ditujukeun sareng hemat biaya tanpa ngorbankeun kualitas produk.
Kyomuhimbo, HD sareng Brink, HG. Aplikasi sareng strategi imobilisasi laccase anu ngandung tambaga; ulasan. Heliyon 9, e13156 (2023).
Waktos posting: 15 Désémber 2025